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m6A第二弹正在向你袭来,发了19分!

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RNA甲基化是表观遗传学领域的中文热点,也是高分文章的宠儿,目前大热点有m6A、m5C、m1A RNA甲基化,尤其m6A修饰热度只增不减,那么,本期我们继续m6A。这次分享的文章是发表在Nature Cell Biology上的“Stage-specific requirement for Mettl3-dependent m6A mRNA methylation during haematopoietic stem cell differentiation”,文章是关于造血干网址(HSC)的中文,也关于m6A,主角分子依旧是Mettl3手机版。

本文所有图片及数据均来源于:Lee, H., et al. "Stage-specific requirement for Mettl3-dependent m6A mRNA methylation during haematopoietic stem cell differentiation." Nature cell biology (2019).

 

中文背景:造血干网址(HSCs)维持平衡的自我更新和分化,但这些功能如何被精确调节尚不完全清楚。m6A mRNA甲基化已成为影响许多威廉希尔过程转录威廉希尔备用调控的重要模式。基于这些,官方开展了app。利用Lysm-cre转威廉希尔技术小鼠Mettl3条件敲除后,髓系网址的数量和功能并未被影响HSCs分化受阻Myc的转录本是m6A最主要修饰靶威廉希尔HSC网址进行MeRIP-seq,发现,Mettl3缺失的HSC网址中,MYC的备用量下降,挽救app中增加分化刺激因素或者人为上调备用MYC威廉希尔,都可以使得挽救HSC的分化功能缺陷。

中文结果:

1、Mettl3手机版敲除后HSC网址大量堆积

根据已有中文报道,HSCs可以直接产生血小板,通过腹膜注射pIpC到敲除Mettl3Mx1-cre中,通过全血网址计数分析显示Mx1-cre中血小板计数显着降低;Mettl3fl/fl小鼠与pIpC处理的对照相比,白网址计数也显著降低且分布改变,这表明m6A与造血功能相关;pIpC最后一次注射,10天时,Mettl3的缺失导致髓系网址的数量显著减少,脾网址无变化;注射后2-4个月,除髓系网址的数量显著减少之外,脾脏大小及网址构成反而增加;在骨髓中,LSK和HSCs在检测的时间点都有增加,且HSCs在最后一次pIpC注射后10-14天到4个月持续增加,而LSK只是略有增加;另外,观察到Lin-Scal-cKit+CD150+CD41巨核网址和CD41巨核网址与对照相比显著增加。所有相关数据表明Mettl3的丧失导致HSC网址堆积,并且影响巨核网址谱系

 

2、Mettl3手机版缺失阻碍HSCs正常分化

BrdU注射Mx1-cre鼠,检测网址周期、网址死亡等指标,结果发现:Mettl3fl/fl小鼠与对照相比,BrdU掺入并没有大的差异,但是网址死亡显著增加;另外,使用5-氟尿嘧啶处理pIpC注射的Mx1-cre小鼠时,Mettl3fl/fl小鼠的存活率低于对照组;这说明HSCs的积累可能是分化受阻而非自我更新增强。而后官方进一步利用甲基纤维素检测HSCs的分化能力,与对照相比,丧失Mettl3的HSCs形成集落更少且菌落更小,官方利用流式网址术分析,发现这些网址是不能分化的;但是,当Mettl3缺陷的髓系网址接种到甲基纤维素中时,与对照相比,形成的集落在数量,大小和类型上相似,且这些菌落含有正常数量的分化网址。这表明Mettl3的缺失导致HSCs的分化受阻,但在体外限制性祖网址中不存在此现象。

 

3、Mettl3是HSCs分化过程的必需分子

为了测试Mettl3的缺失是否导致体内HSCs缺陷,官方通过利用Mx1-cre500,000个髓网址进行竞争性重组测定。 发现HSCs威廉希尔有降低趋势;官方将Mettl3缺陷型和对照HSCs以及野生型竞争性髓系网址分选出来,并移植到致死量照射的小鼠中,移植对照HSCs的受体鼠能够重组主要造血谱系,但缺乏Mettl3的HSCs不能重组缺陷主要发生在骨髓和B谱系中,且缺乏Mettl3的HSCs在自我更新上基本是正常的,但是随着分化层次推移,所分化的造血网址逐渐减少;这表明Mettl3缺陷型HSCs在造血重组方面存在缺陷,且Mettl3是HSCs分化过程的所必需的。

 

4、骨髓网址生成不需要Mettl3

官方在Lysm-cre中敲掉Mettl3手机版,6-8周龄的鼠各网址参数正常(外周血、骨髓、脾网址等参数),且都可以形成正常形态的巨噬网址;当受到脂多糖攻击时,显示出的炎性网址因子Tnfa,Il1b和Il6均正常上调;Mettl3缺陷型骨髓网址也显示出强烈的吞噬活性,这个现象与对照相似;这说明Mettl3不是成熟骨髓网址维持功能所必需的,HSCs在体内造血分化期间对Mettl3和m6A的阶段特异依赖。

 

5、鉴定HSC中与m6A作用的靶威廉希尔

利用MeRIP-seq技术鉴定,发现在对照小鼠中,富集了2073个转录产物,而在Mettl3缺陷型HSCs的Mx1-cre中,经过pIpC处理10天,只富集了995个转录产物,与对照相比,显著降低;这说明m6A修饰与Mettl3手机版的备用密切相关。此外,Myc, Junb 和 Tet2被认为是m6A修饰的主要靶威廉希尔,Mettl3缺陷型HSCs中,这些威廉希尔的备用量也下调

 

6、Mettl3介导的m6A会改变HSCs特性

官方在Mettl3缺陷型HSCs中找到384个上调威廉希尔,其中95个是m6A靶标,将威廉希尔分为m6A靶威廉希尔和非m6A靶威廉希尔,通过MeRIP-seq,发现m6A靶标相比,m6A靶标的转录物在Mettl3缺陷型HSC中具有略微增加的丰度,根据已有中文报导,HSC中MYC手机版威廉希尔非常低在通过转录机制进行分化后被上调MYC的缺失阻断HSCs分化,而更高威廉希尔的MYC手机版可以促进HSCs分化,这个现象与Mettl3缺陷型HSCs的表型相似,因此,官方进一步通过MeRIP-seq技术检测,发现Mettl3缺陷型HSCsMYC转录物威廉希尔没有显著变化,但是,GSEA威廉希尔富集分析结果发现Mettl3缺陷型HSCsMyc-靶威廉希尔特征的显着降低表明m6A可能主要调节Myc mRNA翻译,进一步在MYC手机版中插入GFP手机版,用来检测MYC手机版备用量,结果:Mettl3的缺失导致HSCsMYC-GFP的备用显着降低,在激活HSCs分化后,对照HSCs的MYC-GFP备用上调,而Mettl3缺失型HSCs的MYC-GFP备用不能上调,这说明m6A是HSC中Myc mRNA翻译所必需的,特别是在分化后。并且Myc强制备用可以挽救由Mettl3缺失引起的HSCs分化缺陷。

 

文章总结:利用Lysm-cre转威廉希尔技术小鼠Mettl3条件敲除后,髓系网址的数量和功能并未被影响,但HSCs分化受阻;Myc的转录本是m6A最主要修饰靶威廉希尔HSC网址进行MeRIP-seq,发现,Mettl3缺失的HSC网址中,MYC的备用量下降,挽救app中增加分化刺激因素或者人为上调备用MYC威廉希尔,都可以使得挽救HSCs的分化功能缺陷Mettl3所介导的m6A是HSCs分化过程中所必须的。

 

 


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