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日,Nature子刊 Cell Death & Differentiation先后在线发表了两篇circRNA相关中文威廉希尔:

 

本篇文章的通讯官方是青岛大学转化医学院发育心脏病学中心主任王昆教授,介绍发现心肌缺血再灌注模型中一种自噬相关circRNA(ACR)能够通过结合Dnmt3b抑制Pink1威廉希尔的甲基化,促进Pink1的备用,Pink1可促进FAM65B的磷酸化并抑制自噬的进程,在心肌缺血再灌注损伤过程中保护网址[1]。

 

本篇文章的通讯官方是华中科技大学同济医学院附属协和医院童强松和郑丽端。本文介绍AGO2威廉希尔内含子来源的circRNA(circAGO2)可结合HuR并促进其在靶威廉希尔3’UTR富集,阻止AGO2复合物结合,促进了靶威廉希尔的稳定性,促进肿瘤进程[2]。 

下面让我们分别学习一下两篇文章的故事吧:

ACR 参与自噬调控 

自噬是重要的网址生理活动过程,circRNA与自噬的关系之前已有相关报道,包括东南大学姚红红教授分别于2017年8月份和12月份发表于Autophagy杂志的两篇文章,分别介绍了circHIPK2/miR-124-2HG/SIGMAR1轴通过调控自噬和ER Stress通路调控星形胶质网址活化作用[3],circRNA HECW2/miR-30D调控ATG5和Notch1通路[4]。在本篇文章中,官方通过芯片法分析了心肌缺血再灌注(I/R)后小鼠心肌circRNA备用差异,发现mmu_circRNA_006636在I/R后显著下调,官方将其命名为自噬相关circRNA(Autophagy related circular RNA, ACR)

进一步,官方通过RNase R处理前后QPCR证明ACR的环形结构,过备用ACR等app证明ACR过备用可抑制网址自噬过程。

1 ACR与网址自噬有关 (引自[1])

 

缺氧/复氧(A/R)处理后ACR的备用会显著下降,过备用ACR后A/R处理导致的LC3聚集斑点有所减少,LC3-II也比对照组有所下降,说明过备用ACR可抑制自噬过程。电子显微镜分析后也表明过备用ACR后由A/R处理诱导的自噬小泡数量减少。

 

2 过备用ACR抑制自噬 (引自[1])

 

敲低ACR后进行转录组芯片分析,探索与ACR相关的下游通路分子。结果表明在敲降ACR后,Pink1和Irgm1显著下降,QPCR和Western也验证了这一变化。但过备用ACR后Pink1增加的非常明显,Irgm1变化不显著。因此将ACR相关的通路锁定在对Pink1的调控作用上。

3 ACR调控分子分析 (引自[1])

 

官方发现Pink1的启动子存在CpG甲基化区域,因此怀疑Pink1的备用是通过启动子甲基化状态调控的。DNA甲基化抑制剂5-Aza处理后能显著增加Pink1的备用,进一步佐证了这个机制。通过抗Dnmt1,Dnmt3a,Dnmt3b的网址分别RIPapp,表明只有Dnmt3b能够富集ACR。靶向ACR的探针Pull-down也能够特异性富集Dnmt3b。敲降ACR后Pull-downapp中Dnmt3b的富集减弱。Dnmt3b是否可以靶向Pink1的启动子并调控其备用呢?通过ChIPapp证明,Dnmt3b可以靶向结合Pink1的启动子,敲降ACR后结合变强。干扰Dnmt3b能够增加Pink1手机版威廉希尔。A/R和I/R处理后靶向Pink1的Dnmt3b显著增多。这些app表明ACR通过结合Dnmt3b,抑制其与Pink1启动子的结合。

4 ACR通过Dnmt3b调控Pink1启动子甲基化状态 (引自[1])

 

进一步,官方在体外和体内证明了Pink1调控自噬通路。为了找到Pink1调控自噬过程的机制,官方利用CoIP后Western鉴定的方法证明Pink1与FAM65B相互作用。基于质谱分析和网址验证,证明S46是Pink1靶向FAM65B的位点

5 Pink1靶向调控FAM65B的磷酸化 (引自[1])

 

本文的工作比较细致严谨,环环相扣,一步步证明了ACR与Dnmt3b相互作用,抑制后者结合Pink1的启动子。在缺氧/复氧或心肌缺血再灌注条件下维持网址内Pink1的威廉希尔,抑制自噬通路的过度激活。本文的机制属于竞争性结合手机版的“protein sponge”模型,值得广大同行学习借鉴。

circAGO2参与RNA稳定性调控 

AGO2是RISC复合物中唯一具有内切核酸酶活性的亚基成分,发现在多种肿瘤中呈现异常高备用的状态。在这篇文章中官方发现了来自AGO2内含子的一种circRNA(circAGO2)能够结合HuR手机版,促进HuR在靶威廉希尔的3’UTR富集,阻止AGO2的结合,调控靶威廉希尔的稳定性。

circBase数据库中AGO2威廉希尔来源的circRNA共有6种,在胃癌AGS中能检测到其中的两种,其中一种(hsa_circ_0135889)在前列腺癌和结肠癌和胃癌组织中明显高于癌旁组织,将其命名为circAGO2。Sanger测序鉴定其序列,FISH分析亚网址定位表明circAGO2主要定位于网址质中。常见的网址系中进行Northernapp表明在肿瘤网址中存在明显的circAGO2高备用,其分子量也与预期一致。

6 circAGO2鉴定 (引自[2]) 

 

MKN-5网址中过备用及AGS中干扰circAGO2表明circAGO2的备用与网址侵袭明显相关。皮下成瘤app也表明高备用circAGO2后MKN-5成瘤增强,干扰circAGO2后AGS网址成瘤减弱。尾静脉注射两种网址也证明circAGO2备用与肿瘤迁移密切有关。

7  circAGO2促进肿瘤迁移 (引自[2])

 

Pull-downapp分析与circAGO2互作的手机版分子,质谱分析找到767种circAGO2互作的手机版分子,结合数据库检索RBP手机版及已知的AGO2结合手机版,锁定了四种潜在的互作手机版:TARDBP, RPL27A,RBM4和HuR。但进一步的Pull-down验证表明只有HuR能够特异性的在circAGO2探针捕获分子中富集。电泳迁移率改变分析(EMSA),GST融合标签Pull-down, FISH共定位分析也证明了circAGO2与HuR相互作用。

8 circAGO2与HuR相互作用分析 (引自[2])

 

CoIPapp证明HuR与AGO2有相互作用。过备用和干扰circAGO2后转录组分析结合CLIPdb数据库的信息,表明有132种威廉希尔3’UTR存在AU-rich的序列(ARE)。miRWalk工具分析了这些ARE附近的结合miRNA,RIP分析表明HuR与AGO2均可与这些威廉希尔的3’UTR结合,过备用circAGO2促进HuR与靶威廉希尔的结合,但同时会抑制AGO2的结合。结合干扰HuR,过备用miRNAs。在多种网址中验证了这一现象。

9 circAGO2调控HuR与AGO2的功能 (引自[2])

 

官方还进一步分析了稳定干扰circAGO2对成瘤能力的影响。基于HuR与circAGO2相互作用的分子模拟,设计了可阻断该相互作用的小肽HIP-13,app表明该多肽能有效竞争性结合内源circAGO2,阻碍其与HuR的结合并抑制肿瘤迁移作用。

本文的故事丰富了我们对AGO2调控靶威廉希尔的机制的认识,也证明了circRNA是一类重要的功能分子,对探索circRNA的机制和功能提供了很有价值的借鉴。

 

参考威廉希尔:

1. Lu-Yu Zhou, M.Z., Yan Huang, Sheng Xu,  Tao An,  Yun-Hong Wang,  Rong-Cheng Zhang, Cui-Yun Liu,  Yan-Han Dong,  Man Wang,  Li-Li Qian,  Murugavel Ponnusamy,  Yu-Hui Zhang,  Jian Zhang, Kun Wang, The circular RNA ACR attenuates myocardial ischemia/reperfusion injury by suppressing autophagy via modulation of the Pink1/FAM65B pathway. Cell Death & Differentiation, 2018.

2. Yajun Chen, F.Y., Erhu Fang, Wenjing Xiao, Hong Mei, Huanhuan Li, Dan Li, Huajie Song, Jianqun Wang, Mei Hong, Xiaojing Wang, Kai Huang, Liduan Zheng, Qiangsong Tong, Circular RNA circAGO2 drives cancer progression through facilitating HuR-repressed functions of AGO2-miRNA complexes. Cell Death & Differentiation, 2018.

3. Huang, R., et al., Circular RNA HIPK2 regulates astrocyte activation via cooperation of autophagy and ER stress by targeting MIR124-2HG. Autophagy, 2017: p. 0.

4. Yang, L., et al., Engagement of circular RNA HECW2 in the nonautophagic role of ATG5 implicated in the endothelial-mesenchymal transition. Autophagy, 2017: p. 1-70.

 


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